Objetivo

Caracterizar los perfiles de MALDI-TOF-MS de la bacteria Gluconacetobacter diazotrophicus crecida en los medios P y M.

Diseño experimental

Se trabajaron sobre triplicados biológicos de la bacteria Gluconacetobacter diazotrophicus crecida en los medios P (3 placas) y M (3 placas). No se registró crecimiento en el medio TSA. Cada uno de estos replicados biológicos fue procesado por quintuplicado experimental (5 spots de la placa de MALDI-TOF-MS). Por último, se realizó un triplicado técnico de cada replicado experimental. De esta forma, se obtuvieron un total de 90 espectros (6 * 5 * 3).

La metodología utilizada para el procesamiento de los espectros y el análisis estadístico se realizó según Cáceres et al.

Los espectros se promediaron a nivel de los replicados técnicos, resultando en 30 espectros promediados, 15 medio P y 15 M. Se obtuvo la matriz de intensidades espectrales de 30 filas (los 30 espectros) y ~80 columnas (los ~80 picos detectados). A partir de esta matriz, se generó la versión dicotómica de la misma, en la que los valores continuos de intensidades se tranforman en 0 y 1 [Cáceres et al].

Resultados

Main spectrum y Bruker ID

  • Estos espectros son el promedio de los 15 espectros promediados. De esta forma. cada uno de estos espectros es el promedio de 45 espectros.

  • La ID con el software Flex Analysis en ningún caso arrojó valores mayores a 1.4 de score.

Análisis no supervisado

El heatmap muestra el grado de disimilitud (azul) y similitud (rojo) entre la información de los 30 espectros, en función de la categoria de interés (Medio M /Medio P).

Matriz intensidad

Matriz dicotomizada

  • La información de la matriz dicotomizada presenta una mayor disimilud entre la bacteria crecida en los distintos medios.

Análisis mixto

Primero se seleccionaron los 40 picos discriminantes según el análisis supervisado Binary Discriminant Analysis (BDA).

  • El gráfico muestra los 40 mejores picos con expresión diferencial detectados por el algoritmo BDA. En este gráfico, se comparan los t-scores de cada pico (m/z) entre y dentro los distintos medios de cultivo. Valores positivos y mayores a 2.5 de este score indican presencia significativa (Up-regulated), mientras que valores negativos y menores a -2.5 indican ausencia significativa (Down-regulated) en ese medio de cultivo.

Luego, se redujeron las dimensiones de la matriz dicotómica a estos 40 picos. Con la matriz reducida, se realizó el análisis no supervisado Hierarchical k-means clustering. Finalmente, la visualización de los datos se hizo mediante el Principal Component Analysis (PCA).

  • Las elipses de cada cluster representan un 95% de confianza desde el centroide, considerando una distribución normal multivariada.

  • Las dimensiones 1 y 2 explican el ~85% de la variación total de los datos.

Pureza de los clusters

  • La homogeneidad de los clusters es del 100% para los dos grupos.

Interpretación

* Los clusters del análisis mixto aparecen como 2 grupos no superpuestos (95% de confianza) y las dos mejores componentes principales (Dim1 y Dim2) explican más del 70% de la variación de los datos, lo que indica una separación significativa de los clusters.

La homogeneidad de los clusters es del 100% para los dos grupos.

La información de los espectros permite separar a los aislamientos de Gluconacetobacter diazotrophicus crecidos en medio M de los crecidos en medio P de manera satisfactoria.

Los perfiles de MALDI-TOF-MS de Gluconacetobacter diazotrophicus crecido en estos dos medios son lo suficientente distintos como para agrupar a los aislamientos en dos clusters diferenciales y homógeneos.

* El resultado de la ID de los 90 espectros generados con la base de datos de Bruker, fue siempre no confiable. Es posible, que el main spectrum que contiene la base de datos sea de la bacteria crecida en otro medio, y que el perfil sea lo suficientemente distinto como para no parecerse a los aislamientos que se probaron.

Contacto:

Martin Manuel Ledesma
ResearchGate